熒光顯微鏡技術的基本原理是利用熒光劑使細胞成分具有高度具體的視覺效果，如在目的蛋白后面連接一個通用的熒光蛋白-GFP。在組織樣本中，如果目的基因不能克隆，則需要使用其他技術手段來觀察目的蛋白，如免疫熒光染色。為此，抗體需要連接各種不同的熒光染料，并直接或間接地與相應的靶結構結合。此外，在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡技術不僅局限于蛋白質，還可以染色核酸、聚糖等結構，即使是鈣離子和其他非生物質。本文詳細介紹了幾種常用的熒光劑。

　　免疫熒光(IF)

　　在熒光顯微鏡技術中，你可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白：使用內源熒光信號，即通過克隆將熒光蛋白與目的蛋白連接起來;或者將熒光標記的抗體特異性與目的蛋白結合起來。**種方法對一些生物學問題更有用或更必要。例如，熒光蛋白不能用于組織樣品，因為一般來說，標本是從不能保存熒光蛋白的生物體中獲得的。此外，當有功能抗體可用時，免疫熒光法比熒光蛋白技術快得多，因為后者必須先克隆目的基因，然后將DNA轉移到適當的細胞中。熒光蛋白的另一個缺點是它本身屬于蛋白質。因此，這些熒光蛋白在細胞中具有特定的蛋白質特性，會導致附著的目的蛋白質功能障礙或誤解。然而，熒光蛋白技術仍然是觀察活細胞的**方法。

　　免疫熒光法利用抗體與相應抗原特異性相結合的特性，有兩種不同的表現形式。最簡單的方法是使用熒光標記抗體，它可以與目的蛋白結合。這種方法被稱為直接免疫熒光法。

　　在許多情況下，我們可以使用兩種不同特性的抗體。**種抗體可以與目的蛋白結合，但它本身沒有熒光標記(**種抗性)。**種抗體本身攜帶熒光染料(**種抗性)，并可以與**種抗性結合。這種方法被稱為間接免疫熒光法。這種方法有許多優點。一方面，它會產生放大效應，因為不止一種二次抗性可以與一種抗性相結合。另一方面，沒有必要始終用熒光染料標記目的蛋白，但市場上可以使用熒光標記的二次抗性。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括FITC、TRITC或一些Alexaflur染料，如下所述。

　　FITC和TRITC

　　異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機熒光染料。目前，該熒光染料仍用于免疫熒光和流細胞手術。在495/517nm處，該染料會產生刺激/發射峰值，并可與異硫氰酸鹽反應基團與不同抗體結合。該基團可與蛋白質上的氨基、硫基、咪唑、酪氨酰、堿基等基團結合。其基本成分-熒光素，摩爾質量為332g/mol，常用作熒光示蹤劑。FITC(389g/mol)是熒光顯微鏡技術中首批用于熒光顯微鏡技術的染料，被視為后續熒光染料的起點，如Alexaflur488。該染料的熒光活性取決于其大共軛芳香電子系統，受藍光譜中光的刺激。

　　另一種經常與FITC同時使用的染料是TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反，TRITC不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明還擁有一個大型共軛芳香電子系統，這導致了它們的熒光行為。另一點是，與FITC相反，TRITC(479g/mol)受綠色光譜中**波長為550nm的光的刺激，其**發射波長為573nm。它還基于異硫氰酸鹽反應基團與蛋白質(如抗體)結合。

　　雖然FITC和TRITC仍在使用中，但由于它們**的顯微鏡技術，因為它們屬于發光相對較弱的熒光染料，其優點只是經濟實惠。

　　圖1：果蠅胚胎發育，綠色：FITC;紅色：TRITC。

　　青色素

　　這種熒光染料相對較少，來自青色素，這也是它名字的起源：Cy2。Cy3。Cy5和Cy7。所有上述青色素都可以通過其反應基與核酸或蛋白質連接。例如，馬來酰亞胺基團用蛋白質標記。有趣的是，Cy5對周圍的電子環境非常敏感，可用于酶測量。附著蛋白質的構象變化會導致熒光發射陽性或陰性變化。此外，Cy3和Cy5也可用于FRET試驗。青色素染料是一種相對較老的熒光染料，但它是其他熒光染料提高亮度、耐光性和量子產率的基礎。

　　AlexaFluor染料。

　　Alexaflur染料是一種帶負電荷和親水性的熒光染料系列。該系列染料范圍廣泛，常用于熒光顯微鏡技術。這些染料的名稱是由其**者Richardpaulhaugland以其兒子Alexhaugland的名稱命名的。產品標識為Molecularprobes(美國生命科學技術公司Lifetechnologies的子公司。注:2014年2月，Lifetechnogies被Thermofisher收購)商標。此外，這些產品標識還涵蓋了相應的激光刺激波長。比如Alexaflur488，應用范圍廣，**刺激波長為493nm，可由標準488nm激光刺激。Alexaflur48的**波長是59。488類似于FITC的屬性。雖然AlexaFlur488是熒光素衍生物，但與FITC相比，它具有更好的穩定性和熒光亮度，pH敏感性較低。所有AlexaFlur染料(如AlexaFlur546.AlexaFlur633)都是不同基礎熒光物質的磺化形式，如熒光素.香豆素.青色素或羅丹明。

　　圖2:小鼠轉基因胚胎.肢間體節，E10.5小鼠轉基因胚胎的五個肢間體節:EpaxialMyf5egFP;GFP-Alexa488免疫組化染色;用Desmin-Cy3染色胚胎肌纖維，用Hoechstsize自上而下揭示細胞核:3.5mm(a)，800μm(b)。圖片來源:AurelieJory，CellulessouchesesesesesesesesesegBMC，IGBMC。

　　圖3:小鼠變成纖維細胞，綠色:F-Actin，FITC;紅色:Tubulin，Cy5;藍色:細胞核，DAPI。圖片來源:德國·海德爾堡·馬克斯·普朗克研究所·GunterGiese博士。

　　DNA染色

　　在熒光顯微鏡技術中，不僅研究蛋白質結構，而且核酸也具有重要的研究意義。有時，細胞的準確位置和數量必須通過檢測細胞核來確定。最常用的DNA染色劑之一是DAPI(4、6-2-2-2-苯基消炎)，它可以與DNA雙螺旋A-T富集區結合。如果DAPI附著在DNA上，其熒光強度將高于自由狀態。染色劑受**波長為358nm的紫外線刺激，其發射光譜非常寬，達到461nm的峰值。此外，弱熒光的RNA結合也可以檢測到。在這種情況下，發射波長將轉移到500nm。有趣的是，DAPI可以穿透整個細胞膜。因此，它可以用于固定和活細胞。

　　**種廣泛使用的DNA染色劑是Hoechst染料系列，它們最初是由Hoechstag化學公司生產的。Hoechst33258.Hoechst3342和Hoechst34580均為雙苯酰亞胺，可嵌入A-T富集區，因此該系列染料很少使用。與DAPI類似，這三種染色劑都能受到**發射波長為455nm的紫外線刺激，而未結合的染色劑**發射波長在510-540nm之間。Hoechst染色劑也具有細胞滲透性，因此可用于活細胞或固定細胞。染色劑和DAPI的區別在于毒性低。

　　碘化丙啶(Propidium-Iodide，PI)是一種不能通過細胞膜的DNA染色劑。由于上述特性，染色劑不能進入完整的細胞，因此染色劑通常用于區分細胞組中的活細胞和死細胞。此外，碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對于不同的堿基沒有結合差異。染色劑與核酸結合后，**刺激波長為538nm，**發射波長為617nm。未結合PI的**刺激和發射波長和光強較低。PI也可以與RNA結合，無需改變其熒光特性。有時，為了區分DNA和RNA，有必要使用適當的核酸酶。

　　無需早期處理，就可以識別DNA和RNA。與DNA結合后，**刺激/發射波長為502nm/525nm，而與RNA結合后，**刺激/發射波長為460nm/650nm。此外，它還可以進入溶酶體和其他酸性區域。在這里，陽離子染料被質子化。在這種酸性環境下，由藍色光譜中的光刺激，但發射波長在橙色區域**。由于凋亡細胞有大量被吞噬的酸性區域，因此常用作這些細胞的標記物。

　　區室和細胞器特異性染料。

　　在熒光顯微鏡技術中，溶酶體、核內體等細胞室和線粒體等細胞器經常被染色。為此，本部分介紹了一系列可供選擇的特異性染料。

　　觀察線粒體最常用的方法是使用Mitotracker，它是一種可以通過細胞的染料，包括輕度硫基化的氯甲基活性部分。正因為如此，它可以與半胱氨酸殘留物的游離硫醇基發生反應，從而與基質蛋白結合。Mitotracker有不同的顏色和裝飾類型(見表1)，此外，它也是Molecularprobes的商標。與羅丹明123(Rh123)或tetramethrosamine等常規線粒體特異性染色劑不同，Mitotracker在用固定劑破壞膜電位后不會被洗掉。

　　根據線粒體染色劑，一些染料可以標記溶酶體和其他酸性區域，這被稱為Lysotracker。它們由連接熒光基團的弱堿基團組成，具有膜穿透性。最有可能的情況是，這些堿基因的質子化對酸性區域有親和力。Lysotracker有多種不同的顏色可供選擇(見表1)。

　　類似溶酶體的房間是真菌中的液泡，如釀酒酵母，這也是一個酸性環境。如果您想在熒光顯微鏡下觀察上述房間，請使用FM4-64或FM5-95等苯乙烯基染料。

　　內質網(ER)對蛋白質分泌實驗具有重要的研究意義。染色上述區間的**染料是DiOC6(3)。雖然染料更喜歡ER，但它仍然與線粒體和其他細胞器膜結合。ER特異性染色的另一種方法是使用ER-Trackergren和Red等ER-Tracker，而ER-Trackergren和Red是基于BODIPY的兩種染料，它們與格列本脲(一種磺酰脲酶)相連，可以與僅存在于內質網膜上的ATP敏感鉀通道相結合。BODIPY(硼-二吡咯亞甲基，boron-diPyromethene)是一種幾乎不溶于水的染料基團，對pH相對不敏感。這種染料對蛋白質標記用處不大，但卻是脂質和膜標記的好工具。

　　對于與ER相鄰的高爾基體，可以用NBDC6-ceramide、BODIPYFLC5-ceramide等熒光神經酰胺類似物進行標記。上述神經酰胺是鞘脂，在高爾基體中高度富集。

　　在基于脂質的染料的幫助下，可以對脂筏等特定膜區域進行染色。使用NBD-6Cholestrol或NBP-12Cholestrol可以觀察膽固醇富集區(AvantiPolarlipids)。

　　除了使用特異性非蛋白熒光染料來標記細胞區域外，還可以使用對細胞中不同位置有偏好的蛋白質來染色目標區域。這些蛋白質可以與熒光染料連接，并可以通過熒光顯微鏡觀察到。使用這種方法的一個例子是麥胚凝集素(WGA)可以與細胞質膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結合，將WGA與熒光染料連接起來，這樣我們就可以觀察到細胞質膜。

　　圖4：Pukinje細胞，小鼠小腦皮質三重標記的縱側截面圖。紅色：Anti-calbindin-D28k/Cy3;綠色：Anti-GFAP/Cy5;藍色：Hoechst3258。

　　圖5:牛肺內皮細胞。紅色:用MitotrackerRedCMXRos標記的線粒體;綠色:用綠色熒光BODIPYFLPhallacidin標記的纖維狀肌動蛋白;藍色:用DAPI標記的細胞核。使用三維盲反褶積可以提高圖像質量。

　　離子成像

　　在對神經元的研究中，觀察基因活性或細胞運動對了解細胞的離子濃度具有重要意義。鈉、鈣、氯或鎂離子對許多不同的細胞活性有很大的影響。一般來說，用熒光標記的螯合劑可以困住離子，螯合劑結合相應的離子后會改變離子的光譜特性。例如，利用這一原理的鈣指示劑fura-2.indo-1.fluo-3.fluo-4和calcium-gren。

　　對于鈉離子的檢測，通常使用SBFI(sodium-bindingbofurzanisophthalate)或Sodiumgren。

　　有趣的是，還有基于蛋白質的鈣指示劑，其中一種是基于水母化學發光蛋白的水母素。水母素。發光體腔腸素。分子氧和Ca2+的相互作用會釋放藍光，這是熒光蛋白發現過程中非常有名的機制。