單克隆抗體的基本概念、原理、制備工藝和應用

　　1.單克隆抗體的基本概念。

　　單個B細胞克隆產生的高度均勻，僅針對特定抗原位置的抗體稱為單克隆抗體。雜交瘤(hybridoma)抗體技術通常在細胞融合技術的基礎上，將具有特異性抗體分泌能力的致敏性B細胞和具有增殖能力的骨髓瘤細胞融入B細胞雜交瘤。通過將具有這一特征的單個雜交瘤細胞培養成細胞群，可以為抗原位置制備特異性抗體，即單克隆抗體。

　　2.單克隆抗體技術的基本原理。

　　為了制備單克隆抗體，**需要獲得可合成抗體的單克隆B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。實驗發現，骨髓瘤細胞可以在體外生長和增殖。骨髓瘤細胞與免疫淋巴細胞相結合，通過細胞雜交技術獲得雜種骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承了兩種代際細胞的特征。它不僅具有B淋巴細胞合成抗體的特征，而且具有體外骨髓瘤細胞的培養和增殖的特征。單克隆抗體可由單個融合細胞的細胞組制備。其制備原理如下：

　　3.單克隆抗體制備的基本工藝。

　　(1)免疫動物。

　　免疫動物是利用抗原免疫小鼠產生致敏性B淋巴細胞的過程。一般來說，根據預先制定的免疫計劃，選擇6-8周齡的雌性Balb/C小鼠進行免疫注射。抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應的B淋巴細胞克隆、激活、增殖和分化為致敏性B淋巴細胞。

　　(2)細胞融合。

　　用眼球切除放血法殺死小鼠，無菌手術去除脾臟，擠壓平容器，制備脾細胞懸浮液。將準備好的骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并添加聚乙二醇。在聚乙二醇的作用下，淋巴細胞可以融合成雜交瘤細胞。

　　(3)選擇性培訓。

　　選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，通常使用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，未融合的骨髓瘤細胞無法通過補救方法合成DNA而死亡。雖然未融合的淋巴細胞包括黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但它們不能在體外長期存活并逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞才能在HAT培養基中生存和增殖，因為它們從脾細胞中獲得次黃嘌呤類嘌呤磷酸核糖轉移酶，具有骨髓瘤細胞的特點。

　　(4)雜交瘤陽性克隆篩查克隆。

　　只有少數生長在HAT培養基中的雜交瘤細胞是分泌預定單克隆抗體的細胞。因此，必須進行篩查和克隆。雜交瘤細胞的克隆培養通常采用有限稀釋法。陽性雜交瘤細胞可以通過免疫學篩選出能夠產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。確定單克隆抗體分泌的免疫球蛋白類型、亞類、特異性和親和力后，應及時冷凍。

　　(5)制備單克隆抗體。

　　大量單克隆抗體主要采用動物內誘生法和體外培養法：

　　①體內誘導法采用Balb/c小鼠，先在腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后，雜交瘤細胞在腹腔接種。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，產生和分泌單克隆抗體。大約1-2周后，你可以看到小鼠腹部擴張。用注射器提取腹水，獲得單克隆抗體。

　　②體外培養方法將雜交瘤細胞放入培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集和培養上清液，離心去除細胞及其碎片，獲得所需的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。近年來，新的培養技術和裝置不斷出現，增加了抗體的產量。雜交瘤細胞應在使用前進行篩選。雜交瘤細胞有兩種：一種是篩選雜交瘤細胞;另一種是篩選雜交瘤細胞，它們可以在初選雜交瘤細胞中產生特異性抗體。這兩種篩選方法和原理不同。

　　4.單克隆抗體制備的應用。

　　生命科學實驗具有醫學價值，可用于制備單克隆抗體：

　　(1)凝集實驗:haemaglutination。

　　(2)沉淀反應:Precipitationreaction。

　　(3)ELISA等免疫學檢測。

　　(4)親和分析:分離蛋白質。

　　(5)免疫印記(westernbloting)

　　(6)免疫沉淀。

　　(7)BIAcorebiosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白質的親和力。

　　(8)通過放射免疫學檢測免疫復合物。

　　(9)磁珠分離細胞。

　　(10)流式細胞儀:用于細胞分型和細胞分離。

　　(11)臨床疾病的診斷和**。