DAF-FM DA（新一代用于一氧化氮定量檢測的熒光探針）的使用方法使用方法

一、儲存液制備

2.1   儲存液制備

取低溫保存的凍干粉置于室溫回溫至少20min，低速離心后，加入適量體積的無水DMSO配制成一定濃度的儲存液。比如，往1mg DAF-FM DA（Mw：496.42）加入402.88μl DMSO，充分溶解后配制成5mM儲存液。

2.2   儲存液保存

為了延長儲存液的保存時間，需根據單次用量分裝避光凍存，以最小化反復凍融次數。分裝凍存的溶液至少穩定保存6個月。

2.3   工作液制備

于正式實驗前，用合適的生理緩沖液或新鮮培養基取適量儲存液稀釋到工作濃度。工作液需現配現用，多余的工作液需丟棄。建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

二、操作步驟

【注意】：以下操作步驟僅做參考。**的加載濃度、時間和溫度需根據經驗來調整?？偟膩碚f，以能達到檢測需求的**濃度**。通過降低加載溫度能減緩亞細胞區室化現象。

2.1 細胞懸液或玻片上準備活細胞；

2.2 用適當緩沖液或新鮮培養基（不含血清和酚紅）稀釋DMSO儲存液。建議起始工作濃度范圍是1-10μM。

2.3 用稀釋好的DAF-FM DA工作液孵育細胞20~60min，孵育溫度為4~37℃。貼壁細胞不需消化后再加載。

2.4 用PBS, pH 7.4充分清洗細胞直至去除多余探針。更換新鮮緩沖液或培養基再孵育15~30min，使得細胞內酯酶能將探針充分去酯化。

2.5 激發和發射波長分別是495和515nm。因這些波長與熒光素（fluorescein）非常相似，因此，適用于熒光素（fluorescein）或FITC的檢測系統都行。

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小編zhn2021.11.23