DNA作為遺傳信息的攜帶者和基因表達的物質基礎，在生物體的生長、發育、衰老、遺傳和變異等生命過程中起著極為重要的作用。目前測定DNA的分析方法有很多種，其中熒光探針技術是一種借助高靈敏度光學檢測設備在分子水平上進行實時監測的重要技術手段，具有操作簡單、靈敏度高、選擇性好、可視性強、適應環境能力強等特點，在生物學分析中受到了人們的廣泛關注和研究。熒光標記DNA片段包括熒光標記寡核苷酸探針和熒光標記長片段DNA探針。近年來，用熒光染料對探針進行非放射性標記受到很大重視，并取得了迅速發展，廣泛應用于核酸序列測定、基因檢測以及疾病診斷等。
一、 什么是熒光
當紫外光或可見光照射到某些物質上的時候，這些物質就會發射出波長和強度各不相同的光線，而當紫外光或可見光停止照射時，這種光線也隨之很快地消失，這種光線稱為熒光。
熒光的波長比吸收的紫外線的波長要長些。熒光產生的過程簡單來說，是物質在吸收入射光的過程中，光子的能量傳遞給物質分子，分子被激發，處于激發態的分子不穩定，可通過輻射躍遷的衰變過程而返回基態，衰變過程伴隨著光子的發射，即產生熒光。一些能產生熒光的物質可以運用到生物染色劑中，我們稱之為熒光染料（熒光色素）或熒光探針。
二、熒光淬滅
熒光淬滅一般是指熒光分子通過與溶劑或者與之對應的溶質分子之間的物理或者化學作用從而降低熒光強度的過程。在這個過程中，發光分子的基態壽命會產生一定程度的縮短。
熒光淬滅一般有動態淬滅和靜態淬滅兩類。這些能使熒光發生淬滅的物質被稱作熒光淬滅劑，而熒光淬滅使得熒光物質的熒光量子產率大幅度降低。熒光淬滅還表現在分子受阻碰撞淬滅，自身能量的消失或者轉移，外力阻止的淬滅等。
三、熒光標記寡核苷酸的應用
熒光標記寡核苷酸的應用基礎是核酸雜交原理。通過與目標核酸分子進行各種形式的雜交反應，再采用相關的熒光探針檢測技術，對靶DNA或RNA進行分析。在與修飾寡核苷酸應用相關的診斷測試手段中，熒光檢測（如基于熒光探針的qPCR）是**重要的一類技術。對例如DNA Sanger測序和原位雜交（如FISH）的某些特定應用，寡核苷酸需要單一標記，而用于DNA/RNA實時熒光定量檢測的探針（熒光基團-淬滅劑探針）和用于等位基因鑒別的探針（分子信標），均為雙重標記，即使用熒光基團—淬滅劑對，動態淬滅通過FRET（熒光共振能量轉移）或碰撞淬滅發生。淬滅機制與探針類型有關，一般來說，要么探針打開，增加熒光基團與淬滅劑之間的距離使淬滅停止（分子信標），要么熒光基團或淬滅劑從探針（Taqman探針）上裂解（常見）。
四、熒光基團
1、熒光素標記
寡核苷酸標記熒光素類染料的方法有多種，且標記的選擇多樣化，跟芳香環的氯化程度有關——這決定了染料的熒光發射。衍生自單異構體6-羧基熒光素的6-FAM CE Phosphoramidite、6-HEX CE Phosphoramidite和6-TET-CE Phosphoramidite均可用于寡核苷酸5’端的**標記。
另外兩種可用于寡核苷酸熒光素標記的亞磷酰胺單體：6-Fluorescein-CE Phosphoramidite和Fluorescein-CE Phosphoramidite，這兩種單體都包含與6-FAM CE Phosphoramidite相同的熒光染料，但鏈接骨架不同。6-Fluorescein-CE Phosphoramidite具有1,3二醇結構，其中額外的OH受DMTr保護。這樣不但可以通過DMTr的釋放監測偶聯效率，而且還可以在寡核苷酸中進行多次添加，可用于染色體涂染等。然而，這通常需要在每次添加之間加入一個接頭（例如spacer-18），防止熒光素自淬滅。Fluorescein-CE Phosphoramidite提供了與6-Fluorescein-CE Phosphoramidite相同的可能性，但該種情況下接頭通過硫脲鍵連接至熒光素。
序列內部添加熒光素可通過使用Fluorescein-dT-CE Phosphoramidite取代任意適合的dT殘基實現。同樣可以進行多次添加，但每個fluorescein-dT之間的間距對防止自淬滅至關重要。
寡核苷酸3’端熒光素的標記可通過使用四種不同載體實現。基于取代熒光素5-異構體的3’-Fluorescein CPG以及由6-FAM制備的3'-(6-Fluorescein) CPG，通常均用于此目的。此外，還有同樣源自6-羧基熒光素的3'-(6-FAM) CPG和Fluorescein-dT CPG；其中3'-(6-FAM) CPG可以**阻斷聚合酶向3’末端的延伸以及核酸外切酶活性。
2、菁染料Cyanine dyes（包括QuasarTM染料）
菁染料作為熒光標記的寡核苷酸主要用于分子診斷中的探針制備，例如real-time PCR、熒光原位雜交（FISH）、以及基于表面增強共振拉曼光譜（SERRS）的DNA檢測。它們的發射光譜可以通過改變聚甲炔鏈的長度來調節，并且可以通過芳環上的取代基來改變它們在有機或水性溶劑中的溶解度。
常用的亞磷酰胺染料是Cyanine-3 (Cy3 MMTr CE Phosphoramidite)和Cyanine-5 (Cy5 MMTr CE Phosphoramidite)。這些染料通常在合成過程中連接到寡核苷酸的5'端，但也很容易摻入序列中間。羥基保護基MMT的去除方式與DMTr保護基相同。由于結構中缺少雜環堿基，摻入序列中間并不常見，而且不具備參與堿基配對的能力——會使形成的雙鏈不穩定。
對于3'-修飾，可引入等效的3'-修飾1000?CPG載體，3'-Cyanine-3 (3'-Cyanine-3 CPG) 和3'-Cyanine-5 (3'-Cyanine-5 CPG)。
Quasar染料570和670（亞磷酰胺單體）是熒光吲哚羰菁，分別在橙黃色和紅色區域發出熒光的可見光譜。這兩種染料在熒光探針標記中的應用直接同功于常見的菁染料（Cy?），Quasar570類似Cyanine-3/Cy3，Quasar670類似Cyanine-5/Cy5。與Cyanine-3和Cyanine-5不同的是Quasar染料不能在寡核苷酸序列中間添加。
3、CAL FluorTM染料
CAL Fluor染料是一組專門為qPCR儀器設計的熒光染料。這些新型的呫噸熒光基團可以替代以前的染料，是低成本的替代品。染料可以**制造，并且在寡核苷酸的合成及后處理條件下保持穩定。將CAL Fluor染料與生物分子連接的連接化學消除了多種異構體的問題。這使得染料標記更易于制備、具有單個RP-HPLC峰并具有明確的發射光譜。
CAL Fluor染料可以CPG和亞磷酰胺單體的形式提供，發射波長為520nm至635nm，可與淬滅基團BHQ-1或BHQ-2配對。
4、ROX染料標記
ROX熒光染料（羧基-X-羅丹明）通常用作被動參比染料，為熒光報告染料（即多重qPCR或real-time PCR中的SYBR Green I或TaqMan探針）提供穩定的基線。基線還允許校正移液誤差、熒光波動和儀器漂移，例如燈強度輸出隨時間的變化。由于染料不會干擾qPCR擴增，因此將恒定量添加到所有樣品中作為對照。
根據實驗期間使用的濾光鏡和real-time PCR儀器，可能需要調整ROX的濃度。早期的real-time PCR儀器沒有匹配ROX的濾光鏡，因此需要高濃度來建立基線。后來的儀器使用內標解決了這一短板，以校正光強度。由于ROX染料與所有PCR儀器兼容，現在的儀器已針對ROX光譜設置進行校準，因此無需重新校準熱循環儀。
五、淬滅基團
1、TAMRA標記
TAMRA是寡核苷酸的應用中常用的羅丹明染料。其熒光特性有時用于寡核苷酸標記，但TAMRA更常用作淬滅劑。
TAMRA的光吸收特性以及與幾種常用熒光團（包括FAM、HEX、TET和JOE）的光譜重疊，使其可用作設計雙標探針的淬滅劑。然而，TAMRA的用處有限，因為它的發射光譜廣，這降低了它在多重檢測中應用的能力。其固有熒光產生背景信號，會潛在降低基于TAMRA檢測的靈敏度。盡管存在這些限制，TAMRA已廣泛用于檢測探針的設計，尤其是用于Real-Time PCR的Taqman探針。
寡核苷酸可以使用兩種不同的方法標記TAMRA。TAMRA對強堿不夠穩定，且在氫氧化銨存在下降解。如果需要去保護，則在寡核苷酸的3'-（常見）或5'-末端合成氨基，并使用TAMRA-NHS酯進行合成后標記TAMRA。使用溫和的去保護單體合成的寡核苷酸可以直接用TAMRA標記，或者在序列中間通過用TAMRA-dT-CE Phosphoramidite 取代任何合適的dT殘基，或者在3'-末端使用3'-TAMRA CPG載體。隨后寡核苷酸的脫保護在70℃下使用叔丁胺/甲醇/水（1:1:2）處理2.5小時完成。盡管仍有少量TAMRA降解，但在純化過程中很容易去除。如前所述，TAMRA也是一種熒光基團，雖然是使用廣泛的淬滅劑之一，但應用中通常需要使用黑暗淬滅劑（Dark Quencher）。
2、非熒光淬滅劑
2.1 Dabcyl標記
Dabcyl由于其吸光特性且無殘留熒光，已被廣泛用作診斷探針（如分子信標）中的淬滅劑。在非活性狀態下，分子信標不與靶序列雜交，熒光基團的熒光能量通過碰撞淬滅過程轉移至淬滅劑。為了**地進行光能轉移，熒光基團和淬滅劑必須非常靠近。分子信標的設計中考慮了這一要求，因為莖的兩部分雜交以保持F/Q非常靠近的距離。分子信標探針與其靶序列的雜交導致莖的分離，從而導致F/Q對的分離，產生熒光。
由于Dabcyl對寡核苷酸合成過程穩定，它可以通過修飾子的形式摻入序列中的任何位置：在5'端使用5'-Dabcyl-CE Phosphoramidite——例如在TwistAmp fpg探針上的使用；在3'端使用3'-Dabcyl CPG——例如用于Taqman探針、蝎形引物和分子信標；或在序列中間使用Dabcyl-dT-CE Phosphoramidite——例如在蝎形引物中。
Dabcyl的吸收特性將其可淬滅的染料范圍限制為發射波長為400-550nm（吸收波長為471nm）的染料。然而，當在分子信標中使用時，Dabcyl和熒光基團足夠接近，進而可以淬滅稍寬光譜的染料，從而增加了Dabcyl分子的通用性。
Dabcyl在大多數情況下已被BHQ系列染料取代。
2.2 黑洞淬滅劑
現代基因組和診斷應用的需求通常集中在對更高檢測靈敏度的日益增長的需求上，這導致了一系列新的非熒光淬滅劑的開發。其中**的是Black Hole Quencher?試劑（BHQ試劑），它專門針對基于FRET的淬滅進行了優化。
由于每種BHQ染料具有高消光系數和寬光譜重疊，因此與Dabcyl等分子相比，淬滅效率有所提高。這意味著BHQ染料為不同檢測目的提供了更大范圍波長的使用，覆蓋可見光到近紅外區域（480-730nm）。再加上這些分子沒有殘留背景熒光（是真正的暗淬滅劑），使BHQ染料成為real-time PCR應用的有利選擇。
在四種BHQ淬滅劑中，BHQ-1和BHQ-2更受歡迎，無論5’-Phosphoramidites、dT-Phosphoramidites，或是3’-CPG。如果僅考慮激發和發射值，Cy5、Cyanine-5和Quasar 670需要BHQ-3才能**淬火，但建議使用BHQ-2，因為它不易降解。BHQ-1通常用于在480-580nm范圍內的淬滅，可與常用熒光基團配合使用，如FAM、TET、JOE和HEX。BHQ-2用于在550-650nm范圍內的淬滅，淬滅TAMRA、ROX、Cyanine-3、Cy3、Cy3.5?和Red 640等熒光基團**。每種BHQ亞磷酰胺和CPG均可直接用于自動化合成。
西安齊岳生物生物科技有限公司可以提供熒光標記試劑：Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA、BHQ等。
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