基于DSPE-PEG-RGD@ICG的胃癌靶向近紅外熒光成像納米系統(tǒng)構(gòu)建與評(píng)價(jià)

鏈接：https://www.frontiersin.org/journals/bioengineering-and-biotechnology/articles/10.3389/fbioe.2020.575365/full

作者：Jun Shao，Xiaoming Zheng，Longbao Feng，Tianyun Lan，Dongbing Ding，Zikai Cai，Xudong Zhu，Rongpu Liang，Bo Wei

摘要：

早期診斷和完整切除*是改善胃癌患者生活質(zhì)量的重要途徑。近年來(lái)，近紅外（NIR）材料在*熒光成像方面展現(xiàn)出巨大的潛力。要實(shí)現(xiàn)令人滿意的術(shù)中熒光*成像，有兩個(gè)先決條件：一是獲得具有相對(duì)較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間的穩(wěn)定劑型；二是使其具有良好的生物相容性并能特異性靶向*。本研究開(kāi)發(fā)了一種RGD修飾的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇膠束（DSPE-PEG-RGD）包覆吲哚菁綠（ICG）用于胃癌靶向熒光成像，旨在實(shí)現(xiàn)*靶向富集和近紅外成像。1 H NMR光譜證實(shí)了其分子結(jié)構(gòu)。表征和穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明，DSPE-PEG-RGD@ICG粒徑相對(duì)均一（<200 nm），且具有較長(zhǎng)的熒光穩(wěn)定性。 RGD肽對(duì)整合素αvβ3有很高的親和力，體外共聚焦顯微鏡觀察了其對(duì)SGC7901的特異性靶向作用，體外細(xì)胞毒性和血液相容性結(jié)果與體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)一致，表明其具有良好的生物相容性。利用成像系統(tǒng)觀察了DSPE-PEG-RGD@ICG在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布和*靶向成像，與游離ICG和DSPE-PEG@ICG相比，DSPE-PEG-RGD@ICG在*內(nèi)蓄積更充分，循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)，表現(xiàn)出了良好的*靶向成像性能，為胃癌的檢測(cè)和精準(zhǔn)手術(shù)切除提供了一種有希望的方法。

材料和方法

材料和試劑

二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-Mal，Kw = 2,000）購(gòu)自上海雅爾生物技術(shù)有限公司（中國(guó)上海）。ICG 和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司（中國(guó)上海）。RGD 肽購(gòu)自上海肽業(yè)有限公司（中國(guó)上海）。四氫呋喃（THF）購(gòu)自大茂化學(xué)試劑廠（中國(guó)天津）。RPMI 1640、細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基 (DMEM)、胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶和*生素均購(gòu)自 Gibco（美國(guó)馬里蘭州蓋瑟斯堡）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購(gòu)自凱基生物技術(shù)有限公司（中國(guó)江蘇）。人胃癌SGC7901細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞L929購(gòu)自廣州博真生物科技有限公司。活/死細(xì)胞染色試劑盒購(gòu)自上海百斯寶生物科技有限公司。除另有說(shuō)明外，所有其他試劑均為分析純。

DSPE-PEG-RGD的合成

RGD肽與DSPE-PEG的連接參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法，通過(guò)RGD與DSPE-PEG-Mal的Michael加成反應(yīng)進(jìn)行，并略作調(diào)整（Cureton等，2017）。通常，將20mg DSPE-PEG-Mal溶于5ml超純水中，并與6mg RGD多肽混合。然后，輕輕攪拌混合物4小時(shí)，隨后在透析袋（MWCO：1,000 Da）中用超純水透析24小時(shí)。最終產(chǎn)品通過(guò)冷凍干燥獲得并在-20°C下儲(chǔ)存。

DSPE-PEG-RGD@ICG的合成

DSPE-PEG-Mal為長(zhǎng)鏈聚合物，以PEG（分子量：2,000）為親水單元形成殼層，DSPE（分子量：748）為疏水單元形成疏水腔，ICG為核心。采用自組裝法合成DSPE-PEG-RGD@ICG。具體方法為：將20 mg DSPE-PEG-RGD和6.7 mg ICG溶于3 ml THF中，超聲處理至充分溶解且均勻，然后緩慢加入20 ml超純水。繼續(xù)超聲處理半小時(shí)，將混合物在透析袋（分子量：3,500 Da）中透析24小時(shí)。凍干后得成品，-20℃保存。按照同樣的方案，由DSPE-PEG和ICG制備非靶向的DSPE-PEG@ICG。

DSPE-PEG-RGD@ICG的特性

首先，采用核磁共振（1 H NMR）波譜儀（AVANCE III 500M，Bruker，德國(guó)）分析DSPE-PEG-RGD@ICG的化學(xué)結(jié)構(gòu)。以氘代DMSO為溶劑。采用TEM（JEM-2010F，JEOL Ltd.，日本東京）觀察DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG的形貌。采用Zetasizer Nano-ZS90（Malvern Instruments Ltd.，英國(guó)伍斯特郡）在25 ℃下測(cè)量經(jīng)和未經(jīng)RGD修飾的膠束的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑和粒徑分布。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量三次，取平均值。

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