陽離子脂質體包載熒光標記siRNA技術（Cationic Liposome-Based siRNA Fluorescent Delivery Technology）

陽離子脂質體包載siRNA（熒光）技術，是當前RNA干擾（RNAi）藥物體內遞送中一種被廣泛研究與應用的非病毒遞送策略。該技術利用陽離子脂質體與帶負電荷的siRNA分子之間的靜電作用，形成穩定的脂質體/siRNA復合物，并通過熒光標記實現體外/體內示蹤、細胞攝取評估與分布可視化。該方法具有高效遞送、靶向修飾靈活、低免疫原性、可控釋放等優勢，在腫瘤治療、遺傳疾病、病毒感染等領域展現出廣闊前景。

一、技術核心原理

陽離子脂質體結構組成：

陽離子脂質（如DOTAP、DC-Chol、DODMA）：提供正電荷，與siRNA形成復合體；

中性輔助脂質（如DOPE、Cholesterol）：增強膜融合、穩定性；

PEG化脂質（如DSPE-PEG）：改善血液穩定性、減少網狀內皮系統清除；

靶向/熒光功能脂質（如DSPE-PEG-Cy5、FITC-DOPE）：實現示蹤與細胞成像。

siRNA包載方式：

靜電復合：陽離子脂質體與siRNA混合后，正負電荷相互作用形成脂質/siRNA復合體（lipoplex）；

包載效率與質量比（N/P ratio，常在5:1~10:1）密切相關。

熒光標記方式：

直接標記siRNA：使用FITC-siRNA、Cy3-siRNA、Cy5-siRNA等合成標記鏈；

間接標記脂質體：在脂質體表面插入熒光脂質（如DSPE-PEG-Cy5），標記整個復合體；

雙重標記（siRNA與脂質體同時標記）可用于跟蹤釋放過程。

二、制備方法與步驟

脂質體配制

采用薄膜水化法或微流控法將陽離子脂質與輔助脂質混合成脂質體；

可預先加入熒光標記脂質（如DSPE-PEG-FITC）或膜嵌入式染料（DiI、DiR）。

siRNA包載

將陽離子脂質體與熒光siRNA按設定N/P比混合，在緩沖液中孵育10–30分鐘；

形成均一脂質體/siRNA復合體，大小約在80–200 nm，表面帶正電。

修飾與穩定化（可選）

加入PEG修飾脂質或靶向配體（如抗體、HA、RGD等）；

可進一步冷凍干燥或制成注射用脂質體制劑。

三、關鍵參數控制

四、應用與驗證

細胞攝取實驗

使用FITC-siRNA或Cy5-siRNA脂質體處理細胞，采用共聚焦顯微鏡或流式細胞術（FACS）觀察進入效率；

可進一步使用Lysotracker共染色觀察胞內釋放行為。

RNAi功能驗證

轉染后檢測靶基因mRNA或蛋白水平（qPCR、Western blot）；

可對照裸siRNA或陰性脂質體組。

體內分布成像

Cy5或DiR標記脂質體用于小動物活體熒光/近紅外成像，分析靶向能力與分布時間；

腫瘤模型中可評估腫瘤富集效果。

治療效果評估

熒光siRNA脂質體遞送治療相關基因（如VEGF、Bcl-2、KRAS等），觀察瘤體積變化、存活期等指標。

五、典型應用案例

Cy5-siRNA@DOTAP/Chol/DSPE-PEG脂質體：用于腫瘤靶向沉默VEGF基因，降低血管生成；

FITC-siRNA@DODMA/DOPE脂質體：在pH條件下促使siRNA釋放，用于肺部炎癥治療；

ICG/siRNA共載陽離子脂質體：實現光熱/基因聯合治療，近紅外成像引導；

HA修飾陽離子脂質體遞送siRNA：增強CD44+腫瘤細胞靶向性。

六、優勢與局限

優勢：

包載效率高、結構穩定；

生物相容性好、非病毒遞送安全；

熒光可視化，實現遞送追蹤和治療監控；

可擴展為多功能系統（如靶向、響應、聯合治療）。

局限與挑戰：

陽離子脂質體在高劑量下可能引起細胞毒性與免疫反應；

熒光信號易受猝滅或光漂白影響；

熒光標記的siRNA成本較高，體內穩定性需優化；

長循環與靶向之間存在“PEG屏蔽”效應，需要設計可脫PEG系統。

總結：
陽離子脂質體包載熒光siRNA技術集成了高效遞送、追蹤成像、智能釋放與基因沉默于一體，已成為siRNA遞送體系的重要方向之一。通過結構優化、探針篩選與靶向修飾，該技術可定制適用于腫瘤治療、炎癥調控、基因修復、疫苗遞送等多個前沿領域的解決方案。歡迎提出具體靶點、模型或探針需求，可進一步進行個性化定制設計。

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