辣根過氧化物酶是一種糖蛋白,由于其穩定性好、分子量小、比活性高、特異性強和易于分離提純等特點，廣泛用于酶免疫分析中作為標記物．測定HRP的活性可以間接確定體液或其它組織液中待測抗原或抗體的量．因此，HRP的測定對免疫學和組織化學的研究以及臨床疾病的診斷具有很重要的意義.

HRP的測定目前常用催化光度法,其靈敏度較低，作為底物的鄰苯二胺又具有潛在的致**作用．近年來，基于HRP催化Luminol-HgO?；瘜W發光反應的化學發光酶免疫分析(CELISA)靈敏度很高"，但在通常使用的固相吸附法中，是在固相表面測量化學發光，重現性較差．另外血清樣品中某些蛋白質的非特異性吸附,導致背景信號的升高和信噪比的降低，使其測定靈敏度較之放射免疫分析仍有遜色.

本文提出一種HRP及其標記物的新的化學發光測定方法--一-偶合反應化學發光分析法，該法將HRP催化HgO氧化KI生成I的反應與工uminol-Ig的化學發光反應偶合起來，根據發光強度確定HRP及其標記物的量．此法測定HRP(RZ=2.5-3)的線性范圍是10—6000 pg(或0.25-150 fmol),檢測下限為7pg(或0.18 fmol)，對20 pg HRP進行11次乎行測定，相對標準偏差為7.5%、與HRP催化Luminol-HpO。法比較，測游離HRP的靈敏度提高3倍，測HRP標記物的靈敏度提高10—100倍，能與放射免疫分析相媲美，且克服了上述固相吸附法直接測定HRP的缺陷,提高了測定的選擇性.

實驗

儀器和試劑  LKB-1250發光光度計；ModelSA 720酸度計;微量取樣器(50、100、200、500 uL);酶聯免疫吸附板.Luminol溶液(5.0×10~3moL·dm~3):用0.1 moEdm-8NaHCOg-NaOH溶液容解配制;KI溶液: 2.0×10~3 moL-dm-3，HgO溶液:2.0×10-* moLdm3;HR溶液(1.0:10g-mL-1)、稱取100 mg HRP(RZ=2.5—3),溶解后,用蒸餾水稀釋至100 mL，4℃冰箱保存．使用時用蒸餾水逐級稀釋;HRP的乙型肝炎抗原和抗體等的標記物:HBsAg-HRP、HBsAb-HRP、HBoAb-HRP、PHSAR-HRP。

操作步驟  于26 mL容量瓶中先加入約10mL水后，加入1.0mL EDTA溶液(1.0 g·mL-1),2.5 nL2,0×10~3 moLdm-3KI溶液，2.5 mL 2.0×10~moL·dm-3Hg0浴液,用水稀釋至標線,搖勻備用.

用微量取樣器吸取上述溶液200 pL于酶聯免疫吸附板中，加入100 pL HRP(或其標記物),室溫暗處放置20 min后,取此溶液100 puL放入LKB-1250發光光度計反應室，從儀器加液處加入500 uL5.0×10-3 moL·dm-3 Luminol，記錄反應所產生的光信號強度，同時作空白試驗后,繪制發光強度與HRP濃度間的關系曲線.

結果與討論

偶合反應的時間特性 偶合反應的速度受酶促反應速度和化學發光反應速度兩者影響,在堿性介質中，低濃度的碘氧化Luminol的化學發光反應屬于快速的雙電子氧化的一級反應2,其反應機理為

記錄的化學發光動力學曲線(圖1)顯示出它屬于一種延滯性的快速化學發光，達到發光峰值的時間為1.5s，所以控制偶合反應的主要因素是酶催化HgO氧化KI生成I。的反應，由圖2可見,這一反應經歷兩個階段,在反應開始階段(圖中曲線0A段)，底物分子和酶分子的催化活性中心未能充分接觸，故此時生成Iz的速度較慢;隨反應進行，所有酶的活性中心都參予了反應,生成I2的速度迅速增加(曲線AB段)，且與反應時間呈線性關系，因而可以控制一-定的反應時間(如20 min)進行測定.

偶合反應的條件

酶促反應的pH值﹐研究了HR催化Hg0z氧化KI生成I的反應中p互值的影響(圖3)，發現在pH3.5—3.7范圍內有較大的催化活性，而I2氧化Luminol的反應則以pH10為佳.

圖1 Laminol-化學發光反應的動力學曲線

圖2偶合反應的時間特性

圖3 酶促反應pH值影響

Laminol溶液的濃度 Luminol溶液濃度以及所處介質對Luminol-I2的化學發光反應影響較大,研究結果表明,在0.1 mo L-dm-3 NaHCOg-NaOH介質中,選用5.0×10-8moL-dm-3 Luminol濃度,能獲得更大的發光信號.

H2O2與 KI溶液的濃度 對H2O2與KI的適宜測定濃度進行了試驗，發現當H2O2濃度為2.0×10-5 moL-dm-8、KI溶液濃度為2.0×10-4moL-dm-3時,有利于這一測定的進行.

蛋白質濃度的影響 為了模擬人血清的干擾，我們用牛血清白蛋白代替人血清考察了其加入量對化學發光信號的淬滅影響.結果表明,隨反應混合物中蛋白質濃度增加,化學發光信號逐漸減弱,當其濃度大于0.2 mg.mL1時,化學發光強度接近零．這種蛋白質對化學發光信號的淬滅作用是均相免疫測定的重要障礙，但對酶聯免疫固相吸附法無影響.

EDTA濃度 EDTA可以掩蔽試劑及水中痕量雜質對測定的影響,降低空白信號，因而在測定溶液中加入少量EDTA對測定靈敏度有利,但EDTA量大時對化學發光信號有淬滅作用，兼顧兩者的影響，我們選用1.6—3.2×10~*g-mL-1 EDTA為合適濃度.

HRP濃度與發光強度的關系 在上述適宜條件下測定不同濃度HRP時的化學發光峰值信號，繪制工.作曲線(圖4),在10-6000 pg(或0.25—-150 fmol)HRP范圍內符合直線關系，檢出限為7pg(或0.18 fmol)，對20 pg HRP進行11次平行測定，相對標準偏差為7.5%(表1).

直接催化反應與偶合反應化學發光測定HRP及其標記物的比較研究 HRP直接催化Luminol-HgOg的化學發光反應測定HRP的靈敏度還不夠高（與偶合法比較）,這主要是受到反應條件的限制．HRP催化作用的pH值是中性或弱酸性條件,而Luminol化學發光反應在pH10左右量子產率高.因此,若在酶的適宜活性條件下測定,發光反應量子產率低,測定靈敏度不高;反之,若在發光反應條件下測定，由于HR在堿性條件下不穩定,催化活性中心易破壞而使催化能力喪失,亦得不到靈敏的測定結果.

本文提出的偶合反應成功地解決了這一難題．因為HgO:-KI的反應正是在HRP反應pH值條件下進行的，而產物I與Luminol的化學發光反應的p互條件恰好亦是Luminol量子產率高的條件，另外發光反應測定I的靈敏度本身就很高(檢出限為10-9nol.dm—3),此法實際上又是兩種催化反應的偶合,比它們中任何一個單獨催化反應的靈敏度要高得多.

對于HRP標記物的測定,兩類方法靈敏度的差別更為突出．和其它酶一樣，HRP的活·性中心只是其分子的一部分,它存在于分子表面，當其與底物接觸時起催化作用，考察這一催化反應的動力學可知,其催化反應的速度受兩個因素控制:1．擴散速度為底物擴散至酶的活性中心表面,與酶的活性中心接觸,反應后,產物再從酶表面擴散至溶液中;2．酶促反應速度為底物與酶的活性中心接觸后,在酶的參與下進行反應的速度．當HRP處于游離態時,活性中心暴露在分子表面,底物分子很容易與其接觸，因此催化反應速度僅取決于**個因素，符合Michaelis-Menten方程;但是,當HRP被標記到一個大分子蛋白質上后,由于空間位阻效應,使HRP的活性中心與底物的接觸受到阻礙，由于擴散需要一定時間，而化學發光反應速度很快,底物加入的瞬間發光強度即達更大,因而僅有部分酶與底物接觸,參與化學發光反應，故靈敏度不高.

偶合反應克服了上述動力學過程對測定的影響,它先使Hg0與KI底物與標記物經過一定時間的充分接觸，再加入工uminol測定I的化學發光信號，因而使HRP標記物的測定靈敏度大大提高．表2列出采用偶合反應和直接催化反應化學發光法測定HRP及其標記物的結果.

研究表明,無論是測定游離HRP還是其標記物,利用偶合反應化學發光分析法測定的靈敏度均高于直接催化法,因而能很好地用于化學發光酶免疫分析中。

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