穩定同位素標記的高維度代謝組學用于識別植物中缺失的特征代謝

    特征代謝的確切機制及其在植物進化中的重要性仍然是個謎。特征代謝的產物及其相應的生物合成基因對于理解某些代謝普遍存在的原因至關重要。盡管基于質譜（MS）的代謝組學使我們能夠獲得未知特征代謝物、已知代謝物及其對應異構體或類似物的結構特征數據，但分析方法的拓展仍然**必要。在此，回顧總結了使用穩定同位素標記識別未知特征代謝物的**分析方法。

    迄今，地球上大約391000種維管植物中的225種基因組已被測序。由于測序及數據分析技術方法的進步，預計這一數字在不久的將來會迅速增加。現代基因組測序能做到一個物種的全基因組分析或染色體規模的基因組分析。這些方法可用于從測得的基因組中獲得相關代謝類型的詳細信息。

   植物有兩種代謝類型，即初級代謝，次級代謝或特殊代謝。初級代謝對于維持植物的生存**必要，其與包括氨基酸、糖、脂肪酸和脂類在內的代謝物息息相關，且在進化早期即形成，存在于所有已知的植物中。而植物進化出特殊代謝的原因尚不明確；過去十年的研究表明，特殊代謝產物能保護植物抵抗環境脅迫，包括生物和非生物脅迫。為了確定特殊代謝物的作用，對相關生物合成基因修飾或缺失導致缺乏此類特殊代謝物的植物進行比較分析是必不可少的。例如，通過對比野生型和突變體的類黃酮生物合成途徑，能闡明代謝物對氧化和干旱相關脅迫的作用。各種野生型物種的比較遺傳分析揭示了?；慄S酮對紫外線-B具有緩解作用，表明當植物暴露在嚴重的脅迫下時，它們會過度產生特殊的代謝物，表現出一定的緩解脅迫的能力。

     已有研究表明，參與代謝的剩余基因仍然存在于基因組中；然而，由于對應代謝物未被識別，對應基因的功能因此也未能被確認。因此，要確定相應基因的功能，必須揭示相應的代謝物。每一種植物有自己的“特殊代謝組”，其由特殊代謝物組成。植物界中至少有391000個這樣的特殊代謝組。我們應該發展分析方法去識別盡可能多的特殊代謝組。MS是獲取全面代謝組學數據的有力工具。串聯質譜（MS/MS）圖提供了有關代謝產物的結構信息，包括正負離子模式下m/z值和同位素分布信息。在液相色譜（LC）中，代謝產物的化學性質會影響其保留時間；例如，使用普通反相柱進行LC分析時，高極性代謝物保留時間較短，而非極性代謝物保留時間較長，其表明在對代謝物進行歸屬時，盡可能多地考慮到各個數據非常重要。

     根據代謝組學標準倡議，代謝物的化學歸屬分為四個級別：1級：鑒定；2級：注釋；3級：表征；4級：未知；數據分析方法依此進行?，F有的方法在鑒定“未知”代謝物方面依然存在困難。基于MS的代謝組學當前的挑戰之一是開發歸屬未知代謝物的方法。核磁共振（NMR）能夠成功地進行結構鑒定，是因為NMR提供了代謝物的多面或多維譜；而在基于MS的代謝組學中，LC-MS/MS采集的質譜圖也能提供有用的代謝物結構信息。

在此，回顧了LC-MS/MS分析中使用穩定同位素標記測定未知代謝物的先新方法。這類方法中，使用穩定同位素標記的原子會導致目標化合物離子m/z值的偏移。這種偏移有助于確定化合物包含的原子數以及其他特性。

一、將結構異構體或類似物化學歸屬為“表征”

在1級“鑒定”層次中，樣品中檢測到的化合物的LC-MS/MS特征被與真實標準化合物（包括分離代謝物或合成產物）的LC-MS/MS特征進行匹配。在基于MS的代謝組學中，將樣品與標準品共洗脫是先準確的化學歸屬方法。由于可得的標準品有限，研究人員也會使用共享數據庫中的LC-MS/MS數據或MS/MS數據進行研究。在2級“注釋”層次中，樣品中采集到的MS/MS譜被與數據庫譜圖進行比較。然而，由于特殊代謝物的化學多樣性，即使使用了標準化合物和數據庫比對，鑒定和注釋所覆蓋的代謝物也僅僅少于5%。在3級“表征”層次中，通過對化合物MS/MS特征解析，以推測代謝物或代謝物含有的官能團。比如，植物通過生物反應會產生結構異構體和類似物，同分異構體中具有相同骨架和官能團的部分會得到相似的MS/MS圖，而類似物結構中修飾部分的質譜圖會稍顯不同。需要注意的是，這些異構體和類似物結構類似，但通常具有明顯不同的生物學功能。他們的MS/MS譜的相似處可用于分析檢測到的代謝物異構體和類似物之間的關聯（圖1）。利用這種相似性能**發現新的結構異構體/類似物，在已有研究中能增加約40%化合物化學歸屬。

圖1 表征-化學歸屬結構異構體/類似物

未知代謝物亟需更深入的研究方法

“表征”方法的發展使挖掘更多的結構異構體/特殊代謝物的類似物成為可能。對于鑒定目標代謝物的未知異構體/類似物的研究人員來說，比對MS/MS的相似性是一個重要的步驟。一旦核心代謝物的MS/MS被更新到共享數據庫中，其未知的異構體/類似物可能通過MS/MS的相似性與其產生關聯。在植物界，可能還有特殊代謝物具有未被揭示的骨架結構。為了促進這類代謝物的歸屬，亟待更深入的方法。先要做的即是開發用于從代謝組數據中排除已鑒定、注釋和表征的代謝物的方法。

穩定同位素標記譜圖可作為另一維數據

準確的質量分析是確定分子式的關鍵。目前，質譜儀準確度有了**提高，使得質量準確度可達0.1mDa；但是要確定未知代謝物的分子式，僅靠準確度是不夠的。在m/z不超過1500的小分子中，至少會有幾個候選分子式。在超高分辨率分析中，**分子量和同位素峰簇同時被用于確定分子式。在中分辨分析（如使用四極桿飛行時間質譜）中，同位素峰簇因為沒有被分離而難以被利用。這些事實表明，在中分辨分析中還需要其他的定性條件。

穩定同位素標記被用于闡明生物化學和天然產物化學中的結構。生物體可以從含有穩定同位素標記的中間體獲得部分或全部標記的代謝物。NMR分析對比標記代謝物的譜圖和非標記代謝物的譜圖可以準確地進行結構解析。例如，在13C NMR中，非標記代謝物的化學位移和13C標記代謝物的耦合常數代表碳鏈的連接方式。

由于穩定同位素對生物體內特定代謝物的產生沒有**影響，同位素標記可應用于基于MS的植物代謝組學。例如，13CO2被廣泛用來標記植物，然后比較未標記和標記的質譜圖，以確定m/z值的變化（圖2）。根據一級或MS/MS的分析結果計算確定每個原子的數量。利用得到的原子數，結合質量精度和同位素峰簇，可以從一系列可能的候選分子中歸屬得到代謝物的分子式。對于擬南芥樣品，使用13C、15N和34S標記得到的代謝物的質譜圖分析，可以明確代謝物的分子式。

圖2 使用LC–MS/MS和穩定同位素標記的代謝組學示例。

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