基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記和隨時(shí)間變化代謝輪廓分析的外源性代謝物檢測(cè)和鑒定分析方法

建立高準(zhǔn)確度和普適性的外源性代謝物檢測(cè)和鑒定分析方法對(duì)于評(píng)價(jià)**等化合物的安全性至關(guān)重要。基于液相色譜-四極桿串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù)（LC/HRMS/MS），先應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記目標(biāo)原型化合物（13C和2H），再進(jìn)行特征峰識(shí)別和配對(duì)同位素峰過(guò)濾鑒定代謝物，通過(guò)代謝物隨時(shí)間變化的輪廓分析確證代謝物，建立了高準(zhǔn)確度的外源性代謝物檢測(cè)和鑒定分析方法。

該研究使用未標(biāo)記、13C標(biāo)記和2H標(biāo)記的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）處理擬南芥屬T87細(xì)胞，經(jīng)液相色譜高分辨質(zhì)譜分析后進(jìn)行特征峰識(shí)別和配對(duì)同位素峰過(guò)濾，得到83個(gè)候選代謝物，確認(rèn)了26個(gè)2,4-D的代謝物，其中包括10個(gè)已報(bào)道代謝物和16個(gè)新發(fā)現(xiàn)的代謝物。

具體研究策略見(jiàn)圖1。

圖1 T87細(xì)胞中2,4-D代謝物研究策略

該研究共包括三個(gè)數(shù)據(jù)集：1、未加藥組和2,4-D給藥組；2、2,4-D給藥組和13C8-2,4-D給藥組；3、2,4-D給藥組和2H5-2,4-D給藥組，每組細(xì)胞樣品均在加藥0、1、3、7和10天時(shí)間點(diǎn)取樣分析。經(jīng)質(zhì)譜分析后數(shù)據(jù)集1得到30853個(gè)特征峰，扣除未加藥組內(nèi)源性特征峰并進(jìn)行35Cl/37Cl同位素表型分析后，得到潛在代謝物645個(gè)，但這其中仍可能包含大量假陽(yáng)性結(jié)果；數(shù)據(jù)集2得到34559個(gè)特征峰，對(duì)2,4-D給藥組和13C8-2,4-D給藥組在0、1、3、7和10天時(shí)間點(diǎn)的特征峰峰面積輪廓進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（火山圖分析，log2-fold change>|1|和p<0.05）排除內(nèi)源性代謝物，得到差異特征峰1626個(gè)，再進(jìn)行同位素特征峰配對(duì)過(guò)濾（Δm/z 8.0272 Da，質(zhì)量偏差＜5ppm），得到候選代謝物81個(gè)；數(shù)據(jù)集3分析處理流程與數(shù)據(jù)集2相同，得到候選代謝物76個(gè)。綜合數(shù)據(jù)集2和數(shù)據(jù)集3數(shù)據(jù)，總共得到候選代謝物83個(gè)，三個(gè)數(shù)據(jù)集分析流程見(jiàn)圖2。

圖2 數(shù)據(jù)集分析流程（a, 數(shù)據(jù)集1；b, 數(shù)據(jù)集2；c, 數(shù)據(jù)集3）

對(duì)83個(gè)候選代謝物進(jìn)行了鑒定，通過(guò)Metabolizer軟件預(yù)測(cè)了2,4-D可能的所有代謝反應(yīng)和代謝產(chǎn)物，包括Ⅰ相代謝（氧化/脫烷基化/羥基化）和Ⅱ相代謝（葡萄糖醛酸結(jié)合/氨基酸結(jié)合/谷胱甘肽結(jié)合/硫酸結(jié)合）反應(yīng)，得到7029個(gè)推測(cè)代謝物。將83個(gè)候選代謝物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)與推測(cè)代謝物進(jìn)行比對(duì)（質(zhì)量偏差＜5ppm），鑒定得到了26個(gè)代謝物，其中包括10個(gè)已報(bào)道代謝物和16個(gè)新發(fā)現(xiàn)的代謝物。作者等人通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜特征離子先終確證了16個(gè)新發(fā)現(xiàn)代謝物的結(jié)構(gòu)。圖3為推測(cè)的2,4-D在T87細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和代謝物隨時(shí)間變化的代謝輪廓。

圖3 推測(cè)的2,4-D代謝途徑（a）和部分代謝物隨時(shí)間變化的代謝輪廓（b）

根據(jù)代謝反應(yīng)的不同將鑒定的代謝物分為6組（A-F）。根據(jù)每組外源性代謝物隨時(shí)間變化代謝輪廓的不同進(jìn)一步對(duì)鑒定的26個(gè)代謝物進(jìn)行了確證（見(jiàn)圖4）。

圖4 各組代謝物（A-F）隨時(shí)間變化的代謝輪廓分析

該研究建立的基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記和代謝物隨時(shí)間變化的代謝輪廓分析方法有助于外源性代謝物在生物體內(nèi)的準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定，可**減少假陽(yáng)性率，為全面的外源性代謝物的高通量鑒定提供了參考。

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